HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起（三）
日期：
2018-07-20
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那么有了融合标签之后，我们要如何进行定量检测呢？
HiBiT系统提供了三种灵活的方案，第一种就是快速方便的裂解检测方案。
裂解检测系统就是将细胞完全裂解后，试剂中的LgBiT亚基和融合蛋白上的HiBiT标签迅速结合，启动萤光素酶反应，发光的亮度就和细胞内的HiBiT标签多少成正比。
由于萤光素酶反应非常迅速，因此只需要五分钟就可以对样品内的融合蛋白进行迅速准确的定量。
第二种检测系统和Western Blot很像。电泳和转印之后，可以直接使用HiBiT印迹检测系统进行目标蛋白的亲和杂交，然后通过萤光素酶反应进行条带的发光检测。由于不需要封闭和抗体，相比Western Blot既省时又省力。
第三种检测方案是HiBiT胞外检测系统。这个系统专门为研究外泌蛋白或者细胞膜表面蛋白而设计。我们加入的试剂不含有裂解组分，其中的LgBiT只能和细胞膜表面或者分泌到培养基中的HiBiT蛋白结合，这种操作不裂解细胞，因此样品还可以进行其他的细胞分析和分子实验。
在过去的蛋白重组表达中，研究人员通常会使用外源的蛋白表达载体在细胞内进行蛋白表达调控和功能的研究，这种手段简单直接，曾经为我们带来了很多宝贵的成果，但是这种外源表达有相当的局限性。
下图是研究缺氧诱导条件下HiF1A蛋白的积累，我们可以看到，随着携带外源表达蛋白的瞬转质粒浓度的增加，同样的药物处理带来的蛋白表达响应（Fold response）会逐渐减小，这是由于外源蛋白在持续表达启动子（CMV或者PGK）的启动下，不断在细胞内积累，这种积累的蛋白往往超出了细胞本身的蛋白降解水平，这些大量存在而无法及时降解的外源蛋白会形成一个巨大的本底值，即便药物处理能够产生一些表达上的变化，也往往被这个巨大的本底消弭于无形。这种情况下减小外源质粒的浓度或者使用更温和的启动子（例如从CMV变成PGK），能够在一定程度上改善这种情况。
而当CRISPR/cas9技术出现之后，我们可以直接将HiBiT标签加入到内源目标蛋白上，由于HiBiT标签很小，并不会影响内源蛋白的正常功能和调控网络，所获得的结果更能反映真实机理，从图中我们可以看到内源表达的倍比响应是最高的。
借助于CRISPR技术，我们在内源水平上对目标蛋白进行标签knock-in，如果实验室需要对某个蛋白进行调控机理的深入研究，那么获得一个CRISPR knock-in细胞系就是一个既时髦又可靠的操作。
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