图3.评估 KRAS 突变体对 RBD-C-RAF 亲和力的差异及 AMG510 的抑制效应。(A)使用 BiT 标记抗体检测时，RBD-C-RAF-GS与浓度递增的 KRAS-6HIS(野生型或突变体(相互作用导致发光信号增强。(B)AMG510特导性抑制KRAS(G12C)/RBD-CRAF 相互作用，而对野生型及其他 KRAS 突变体(如 G12D/G12V)影响甚微。标注浓度为各孔终浓度。
实验操作流程：
1. 配制 KRAS 交换缓冲液(1xTBS/5mM EDTA/0.5mM MgCl2/1mM DTT)，加入 GTP 至终浓度 10μM。
2. 在 KRAS 交换缓冲液中制备 KRAS 及 KRAS 突变体的梯度稀释液。每孔加入 10μl。
3. 震荡孵育 10 分钟，使活化的 KRAS-GTP 形成。
4. 加入 MgCl2 至 10mM 以螯合 EDTA 并稳定 GTP 结合的 KRAS。
5. 加入 10μl用 1x TBS/1mM DTT 稀释的 200nM RBD-c-RAF，震荡孵育 30 分钟。
6. 加入20ul 用 1x Lumit® lmmunoassay Dilution Bufer A 稀释至 1.5ug/ml 的抗 6HIS-LgBiT 和抗 GST-SmBiT。
7. 震荡孵育 30 分钟。
8. 每孔,加入 10ul 按 1:50 比例用Lumit® |mmunoassay Dilution Buffer A 稀释Lumit® Detection Substrate A。
9. 震荡孵育 2 分钟。
10. 检测发光信号。
11. 抑制实验中，将200nM KRAS(G12C)突变体与不同浓度的小分子抑制剂 AMG510 在缓冲液(使用 1xTBS/1mM DTT制备中预先孵育，使抑制剂与靶点充分结合，后续完全遵循标准 Lumit® lmmunoassay步骤。(详细操作指导请查阅说明书 TM723)
