Promega新产品——细胞自噬检测

Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay

简单的发光法检测自噬流

        Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System是一种基于微孔板的检测，它利用生物发光的LC3报告基因来定量地测定自噬流。轻松的一步操作省去了洗涤步骤，也不再需要复杂的成像系统或流式细胞仪。您可以选择两种制备好的报告细胞系（HEK293或 U2OS），也可以将报告载体稳定转染到您选择的细胞系。

检测原理

         Autophagy LC3 HiBiT Reporter包含与人LC3蛋白融合的HiBiT标签。在诱导自噬时，LC3报告蛋白被自噬体捕获并降解。在加入含有LgBiT蛋白和底物的Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent后，LgBiT与HiBiT标签发生相互作用，重新组成明亮发光的NanoBiT®酶。在多达7个数量级的范围内，发光信号与HiBiT标记的LC3报告蛋白成正比。

数据解读

        自噬报告基因分析的读数是定量的，易于解释。自噬流的增加将加速自噬报告蛋白的降解，导致发光信号减弱。反之，自噬的抑制则会增强报告蛋白水平和发光信号。

自噬诱导: 下降的信号

以每孔20,000个细胞的密度，将HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter cell铺在全白的96孔板上。在细胞附着过夜后，用浓度递增的参照自噬诱导剂PP242对细胞进行指定时间的处理，3个复孔。然后，加入Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent，在10分钟后测定发光。图中显示为应用溶剂对照组对发光信号进行均一化的读数平均值。

自噬抑制：增加的信号

以每孔8,000个细胞的密度，将U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell铺在全白的96孔板上。在细胞附着过夜后，用浓度递增的参照抑制剂Baf A1（不含或含有2μM PP242）处理细胞，时间为21小时。对于每项研究，根据未处理的对照组对发光信号进行均一化。PP242处理明显增加了自噬，减弱了发光信号，让自噬抑制剂Baf A1处理导致的信号增强更加明显。

 Autophagy LC3 HiBiT报告基因载体

        Autophagy LC3 HiBiT Reporter包含人LC3B、N端的HiBiT标签，以及在自噬通路中增强报告基因特异性的中间“Spacer”区域。它利用带有PyF101增强子的组成型HSV-TK启动子，让报告基因在哺乳动物的细胞中实现低至中等水平的表达。该载体还包含新霉素-卡那霉素抗性基因，可通过Geneticin（G418）的选择压力构建稳定的克隆。

HSV-TK弱启动子：在哺乳动物细胞中低水平表达

新霉素抗性基因：用于筛选稳定转染细胞（不建议用瞬时转染细胞进行实验）

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