Lumit®PPI技术应用：生化水平高效监测KRAS与cRAF的相互作用
日期：
2025-09-15
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Lumit®Anti-Tag PPI 技术
用于监测KRAS与cRAF的相互作用
KRAS 是RAS 超家族成员，调控细胞生长、分化和增殖。KRAS 通过与GDP 和GTP 的相互作用分别切换非活性和活性状态。这些转换受鸟苷酸交换因子（GEFs）和GTP 酶激活蛋白（GAPs）调控，GEFs 促进GTP 结合，GAPs 水解GTP 并重启循环。
KRAS 是人类癌症中最常发生突变的致癌基因之一。最常见的突变发生在12、13 和61 密码子，这些突变被认为会干扰GAP 介导的水解作用，导致活化KRAS 的积累。
本文描述利用蛋白标签的Lumit® 蛋白相互作用免疫检测来监测KRAS与效应蛋白c-RAF 的相互作用。该技术还可应用于：
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Lumit® Anti-Tag PPI技术原理及流程Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents以商品化纯化蛋白质的常用亲和纯化标签作为直接分析物，包括：6HiS、GST、FLAG®，生物素以及人lgG。NanoBiT® 萤光素酶是一种结构互补性报告基因，非常适合进行相互作用研究。更多产品详情请查看：新品发布 | 简单、快速、高灵敏度的蛋白质互作检测系统
图1.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测原理。
图2.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测流程。
图3.评估 KRAS 突变体对 RBD-C-RAF 亲和力的差异及 AMG510 的抑制效应。(A)使用 BiT 标记抗体检测时，RBD-C-RAF-GS与浓度递增的 KRAS-6HIS(野生型或突变体(相互作用导致发光信号增强。(B)AMG510特导性抑制KRAS(G12C)/RBD-CRAF 相互作用，而对野生型及其他 KRAS 突变体(如 G12D/G12V)影响甚微。标注浓度为各孔终浓度。
实验操作流程：
1. 配制 KRAS 交换缓冲液(1xTBS/5mM EDTA/0.5mM MgCl2/1mM DTT)，加入 GTP 至终浓度 10μM。
2. 在 KRAS 交换缓冲液中制备 KRAS 及 KRAS 突变体的梯度稀释液。每孔加入 10μl。
3. 震荡孵育 10 分钟，使活化的 KRAS-GTP 形成。
4. 加入 MgCl2 至 10mM 以螯合 EDTA 并稳定 GTP 结合的 KRAS。
5. 加入 10μl用 1x TBS/1mM DTT 稀释的 200nM RBD-c-RAF，震荡孵育 30 分钟。
6. 加入20ul 用 1x Lumit® lmmunoassay Dilution Bufer A 稀释至 1.5ug/ml 的抗 6HIS-LgBiT 和抗 GST-SmBiT。
7. 震荡孵育 30 分钟。
8. 每孔,加入 10ul 按 1:50 比例用Lumit® |mmunoassay Dilution Buffer A 稀释Lumit® Detection Substrate A。
9. 震荡孵育 2 分钟。
10. 检测发光信号。
11. 抑制实验中，将200nM KRAS(G12C)突变体与不同浓度的小分子抑制剂 AMG510 在缓冲液(使用 1xTBS/1mM DTT制备中预先孵育，使抑制剂与靶点充分结合，后续完全遵循标准 Lumit® lmmunoassay步骤。(详细操作指导请查阅说明书 TM723)
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Lumit® Anti-Human IgG-LgBiT and -SmBiT | |
Lumit® Detection Reagent A | |
*Anti-DYKDDDDK 识别常用于标记蛋白质的FLAG® 标签。
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