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完整解决方案之Mo-DCs的获取

日期: 2017-02-06
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树突状细胞(DCs)作为一种专职性抗原提呈细胞,是适应性免疫的基石。研究表明,基于DC的疫苗在肿瘤治疗中具有巨大的免疫治疗潜力。

在基础研究和免疫治疗中会用到大量DCs细胞,通常,我们是用单核细胞经过特定的分化/成熟步骤在体外生产DCs的,即单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DCs)。为了获得成熟、功能性Mo-DCs(单核细胞来源的DCs),很重要的一点就是,要使用可靠的流程和可靠的试剂。

下面,我们来介绍一下美天旎Mo-DCs完整解决方案,包括单核细胞分选、诱导分化/成熟、表型鉴定及功能检测等过程。

单核细胞分离

使用美天旎CD14磁珠从健康供者PBMCs分选出CD14+单核细胞。用CD14-FITC抗体、PI进行流式细胞仪检测。

完整解决方案之Mo-DCs的获取

结果显示,分选出的CD14+单核细胞的纯度为96.8±3.8%,得率为81.3±8.8%%,活性为97.5±1.4%。

Mo-DCs的分化、成熟

Day0:分离出的单核细胞(3×10⁶ cells)用3 mL的完全培养基(RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, 1% autologous plasma),添加250 IU/mL IL-4 、800 IU/mL GM-CSF进行培养。

Day 2:从培养体系吸出1.5 mL,离心。用1.5 mL完全培养基加2倍浓度的IL-4和 GM-CSF,再添加到原培养体系中。

Day 6:从培养体系吸出1.5 mL,离心。用1.5 mL培养基(添加2000 IU/mL IL-6, 400 IU/mL IL-1β, 2000 IU/mL TNF-α, 2 µg/mL PGE₂),再添加到原培养体系中,培养24小时。

Day 7:通过流式检测成熟Mo-DCs (mMo-DCs)的活性为95.4±2.4%,得率为23%。

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Mo-DCs鉴定

形态观察:

显微镜下观察细胞形态:在day0,细胞呈球形,为正常的单核细胞。随着分化和成熟的进行,细胞的大小和颗粒度增加,在day6,细胞形态表现为未成熟Mo-DCs形态,在day7表现为成熟Mo-DCs的形态。

完整解决方案之Mo-DCs的获取

 

流式鉴定:

使用下表中所列流式抗体和MACSQuant 流式细胞仪检测细胞表面的marker和受体的表达。

完整解决方案之Mo-DCs的获取

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Mo-DCs功能检测

抗原递呈能力:

用FITC-labeled dextran评估单核细胞、imMo-DCs或 mMo-DCs的胞吞能力。用流式细胞仪检测平均荧光强度(MFI)。结果表明,imMo-DCs具有最高的抗原提呈能力。

完整解决方案之Mo-DCs的获取迁移能力检测:

mMo-DCs具有向CCL19迁移的能力,并呈现剂量依赖性。

 

完整解决方案之Mo-DCs的获取

 

Mo-DCs诱导naive T细胞增殖的能力:

我们通过混合淋巴细胞反应实验(MLR),来评估Mo-DCs诱导naive T细胞的能力:先用Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II从PBMCs分选出Naive CD4 + T细胞,再分别与Monocytes, imMo-DCs, mMo-DCs共培养7天,然后检测CD4 + T细胞的增殖情况,结果显示:mMo-DCs能够诱导T细胞增殖。

完整解决方案之Mo-DCs的获取

检测Mo-DCs分泌IL-12的能力:

用CD40L刺激后,对mMo-DCs分泌的IL-12和IL-10进行定量分析。结果表明,在CD40L的刺激下,mMo-DCs分泌IL-12。

完整解决方案之Mo-DCs的获取

 此法成功获得了Mo-DCs,其中所涉及的产品美天旎都有哦,快快联系我们吧!

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