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Promega新产品【细胞自噬检测】

日期: 2018-04-08
浏览次数: 623

Promega新产品——细胞自噬检测

Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay

Promega新产品【细胞自噬检测】

简单的发光法检测自噬流

        Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System是一种基于微孔板的检测,它利用生物发光的LC3报告基因来定量地测定自噬流。轻松的一步操作省去了洗涤步骤,也不再需要复杂的成像系统或流式细胞仪。您可以选择两种制备好的报告细胞系(HEK293或 U2OS),也可以将报告载体稳定转染到您选择的细胞系。
Promega新产品【细胞自噬检测】


检测原理

         Autophagy LC3 HiBiT Reporter包含与人LC3蛋白融合的HiBiT标签。在诱导自噬时,LC3报告蛋白被自噬体捕获并降解。在加入含有LgBiT蛋白和底物的Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent后,LgBiT与HiBiT标签发生相互作用,重新组成明亮发光的NanoBiT®酶。在多达7个数量级的范围内,发光信号与HiBiT标记的LC3报告蛋白成正比。

Promega新产品【细胞自噬检测】


数据解读

        自噬报告基因分析的读数是定量的,易于解释。自噬流的增加将加速自噬报告蛋白的降解,导致发光信号减弱。反之,自噬的抑制则会增强报告蛋白水平和发光信号。


自噬诱导: 下降的信号

Promega新产品【细胞自噬检测】

以每孔20,000个细胞的密度,将HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter cell铺在全白的96孔板上。在细胞附着过夜后,用浓度递增的参照自噬诱导剂PP242对细胞进行指定时间的处理,3个复孔。然后,加入Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent,在10分钟后测定发光。图中显示为应用溶剂对照组对发光信号进行均一化的读数平均值。


自噬抑制:增加的信号

Promega新产品【细胞自噬检测】

以每孔8,000个细胞的密度,将U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell铺在全白的96孔板上。在细胞附着过夜后,用浓度递增的参照抑制剂Baf A1(不含或含有2μM PP242)处理细胞,时间为21小时。对于每项研究,根据未处理的对照组对发光信号进行均一化。PP242处理明显增加了自噬,减弱了发光信号,让自噬抑制剂Baf A1处理导致的信号增强更加明显。



 Autophagy LC3 HiBiT报告基因载体

        Autophagy LC3 HiBiT Reporter包含人LC3B、N端的HiBiT标签,以及在自噬通路中增强报告基因特异性的中间“Spacer”区域。它利用带有PyF101增强子的组成型HSV-TK启动子,让报告基因在哺乳动物的细胞中实现低至中等水平的表达。该载体还包含新霉素-卡那霉素抗性基因,可通过Geneticin(G418)的选择压力构建稳定的克隆。


Promega新产品【细胞自噬检测】

HSV-TK弱启动子:在哺乳动物细胞中低水平表达

新霉素抗性基因:用于筛选稳定转染细胞(不建议用瞬时转染细胞进行实验)




特点总结

1、采用蛋白接近生理表达水平的HiBiT-LC3报告基因稳转细胞系

2、发光法定量检测,灵敏度高

3、均质法检测,操作简单

4、分析数据简单(抑制自噬信号上升,诱导自噬信号下降)

5、96-/384-/1536-孔板高通量检测

6、可与荧光法细胞活力、毒性检测试剂叠加

7、可检测2D和3D培养细胞



产品列表:

目录号产品名称组分
报告系统检测系统
GA2550Autophagy   LC3 HiBiT  Reporter Vector and  Detection SystemAutophagy   LC3   HiBiT Reporter   Vector, 20ugNano-Glo® HiBiT Lytic Detection System, 10ml
GA1040HEK293   Autophagy LC3   HiBiT Reporter Cell Line  and  Detection System1  vial HEK293 Autophagy LC3 HiBiT  Reporter Cells
GA1050U2OS   Autophagy LC3   HiBiT Reporter Cell Line  and Detection System1  vial U2OS Autophagy LC3 HiBiT  Reporter Cells


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