服务热线: 010-82349466
新闻中心 News
联系我们

HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)

日期: 2018-07-20
浏览次数: 645

HiBiT标签的检测


那么有了融合标签之后,我们要如何进行定量检测呢?

HiBiT系统提供了三种灵活的方案,第一种就是快速方便的裂解检测方案

裂解检测系统就是将细胞完全裂解后,试剂中的LgBiT亚基和融合蛋白上的HiBiT标签迅速结合,启动萤光素酶反应,发光的亮度就和细胞内的HiBiT标签多少成正比。

由于萤光素酶反应非常迅速,因此只需要五分钟就可以对样品内的融合蛋白进行迅速准确的定量。


HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)


第二种检测系统和Western Blot很像。电泳和转印之后,可以直接使用HiBiT印迹检测系统进行目标蛋白的亲和杂交,然后通过萤光素酶反应进行条带的发光检测。由于不需要封闭和抗体,相比Western Blot既省时又省力。


HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)


第三种检测方案是HiBiT胞外检测系统这个系统专门为研究外泌蛋白或者细胞膜表面蛋白而设计。我们加入的试剂不含有裂解组分,其中的LgBiT只能和细胞膜表面或者分泌到培养基中的HiBiT蛋白结合,这种操作不裂解细胞,因此样品还可以进行其他的细胞分析和分子实验。


HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)


与CRISPR双剑合璧


在过去的蛋白重组表达中,研究人员通常会使用外源的蛋白表达载体在细胞内进行蛋白表达调控和功能的研究,这种手段简单直接,曾经为我们带来了很多宝贵的成果,但是这种外源表达有相当的局限性。


下图是研究缺氧诱导条件下HiF1A蛋白的积累,我们可以看到,随着携带外源表达蛋白的瞬转质粒浓度的增加,同样的药物处理带来的蛋白表达响应(Fold response)会逐渐减小,这是由于外源蛋白在持续表达启动子(CMV或者PGK)的启动下,不断在细胞内积累,这种积累的蛋白往往超出了细胞本身的蛋白降解水平,这些大量存在而无法及时降解的外源蛋白会形成一个巨大的本底值,即便药物处理能够产生一些表达上的变化,也往往被这个巨大的本底消弭于无形。这种情况下减小外源质粒的浓度或者使用更温和的启动子(例如从CMV变成PGK),能够在一定程度上改善这种情况。

而当CRISPR/cas9技术出现之后,我们可以直接将HiBiT标签加入到内源目标蛋白上,由于HiBiT标签很小,并不会影响内源蛋白的正常功能和调控网络,所获得的结果更能反映真实机理,从图中我们可以看到内源表达的倍比响应是最高的。



HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)


HiBiT系列连环画- HiBiT标签的检测方法简单到飞起(三)


借助于CRISPR技术,我们在内源水平上对目标蛋白进行标签knock-in,如果实验室需要对某个蛋白进行调控机理的深入研究,那么获得一个CRISPR knock-in细胞系就是一个既时髦又可靠的操作。


HiBiT精品菜单






Hot News / 相关推荐
  • 2021 - 07 - 13
    点击次数: 22
    说起胰蛋白酶,相信做过蛋白质组学研究的伙伴们都再熟悉不过了。胰蛋白酶作为最为经典的质谱分析样品制备用蛋白酶被广泛使用。不过用胰蛋白酶消化通常提供不完整的序列覆盖或翻译后修饰的缺失鉴定。与胰蛋白酶一样,其他蛋白酶如Lys-C、Asp-N、Glu-C和Arg-C也会在带电荷的残基上裂解,从而使蛋白质中被消化的区域产生偏向。Promega推出的新产品ProAlanase,它在蛋白质组中独特的、非带电的位...
  • 2020 - 11 - 13
    点击次数: 55
    十一返场活动时间:2020.11.16-11.20亲爱的小伙伴,你是否还在为双十一没有尽兴而郁郁寡欢,你是否还在为错过了双十一而掩面哭泣。不要难过,双十一虽然离你而去,但是我们准备了返场活动,咱们再来嗨啊!本次返场活动时间:2020.11.16 - 11.20。活动内容:满额有礼返场,再送一周活动期间单笔订单满5千元,送红运马克杯或机器人USB电脑分线器;单笔订单满1万元,送红色运动套装或限量款旅...
  • 2020 - 11 - 03
    点击次数: 35
    活动时间:11.2—11.13 活动一发照片,抽大奖  提供实验室使用的本公司的产品照片(包含:品牌和货号),即可参与抽奖;活动持续两周,每日名额限量,先发先抽奖哦!参与方式:微信发送关键词“双十一赢好礼”+ 照片,并备注单位,点击链接参与抽奖。 活动二双11狂欢开幕,满额有礼  活动期间单笔订单满5千元,送红运马克杯或机器人USB电脑分...
  • 2020 - 08 - 20
    点击次数: 81
    开学季活动攻略来了        嗨!亲爱的伙伴,我们在2020年的秋季终于见面了!无论你在哪里,我们都会一直默默的陪伴。伴随着金色的九月,开学的季节,我们展开了多种活动,来和你一起开学。活动多多,奖品多多,还在等什么,快来参与啊!活动一:你留言,我送礼! 在本次活动中,亲爱的伙伴,如果你在公众号后台留言,留言入选,便可获得精美礼品。留言...
  • Copyright © 2005 - 2013 北京照生莱博商贸有限公司
    犀牛云提供企业云服务