■应用载体：pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector
■ 应用检测试剂：Dual-Luciferase® Reporter Assay system
■ 研究目的：let-7 microRNA 家族被认为是一类肿瘤抑制因子，可通过结合到Ras 和HMGA2 等蛋白mRNA 的3’-UTR 来下调这些肿瘤形成相关蛋白的表达。在卵巢癌中存在let-7 的下调，而在小鼠肺癌和乳腺癌模型中过表达let-7 可以抑制肿瘤生长。
为了系统性研究细胞中调控let-7 生成的的机制，需要建立一种快速筛选系统来对细胞内的let-7 进行定量。作者建立了一套基于pmirGLO 载体的快速、高度灵敏的let-7 报告基因检测系统。利用该系统可以快速鉴定出影响let-7 活性水平的信号通路，揭示let-7 的调控机制。
■ 研究思路：
• 利用pmirGLO 报告基因载体建立快速筛选let-7 活性的检测系统
根据文献，细胞内多种mRNA 的3’-UTR 上含有let-7 的结合序列，利用pmirGLO 载体构建了6 个带有不同let-7 靶位点（let-7 target site，LCS）的质粒。将这些载体分别转染到两种卵巢癌细胞系UCI-101 和BG-1 中，通过检测过表达的let-7 对萤火虫萤光素酶报告基因表达的下调水平，来筛选出一个抑制程度最强的let-7 靶位点质粒（pmirGLO-let7）用于后续研究。
人源细胞中存在9 种成熟的let-7 miRNA，将这9 种let-7 分别在BG-1 细胞中过表达后再转染pmirGLO-let7 质粒，发现9 种let-7 对萤火虫萤光素酶的表达均有抑制，说明该质粒能够有效应用于监测细胞中整体的let-7 水平。
• 利用转染pmirGLO-let7 质粒的UCI-101 和BG-1 细胞筛选激酶抑制剂以寻找卵巢癌细胞中调控let-7 水平的信号通路
利用pmirGLO-let7 质粒检测了Screen-WellTM 激酶抑制剂库中的80 种化合物对let-7 活性的影响， 发现加入化合物
Kenpaullone 能够明显降低萤火虫萤光素酶的活性，说明该化合物能提高细胞内let-7 的水平。该化合物是GSK-3β 的抑制剂。
• 利用GSK-3β siRNA 进一步验证GSK-3β 与细胞内let-7 水平的相关性
GSK-3β siRNA 下调细胞内GSK-3β 的表达后，pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶的活性降低，与上述抑制剂实验结果吻合，同时BG-1 细胞的存活率下降。下调GSK-3β 的表达后通过RT-qPCR 直接检测到细胞中let-7 miRNA 表达升高。说明GSK-3β可特异性下调let-7 的表达。
• 研究GSK-3β 下调let-7 表达的机制
文献报道结肠癌细胞中沉默GSK-3β 触发的细胞死亡与p53 表达上调有关。作者在BG-1 细胞发现了同样的结果。沉默GSK-3β 引起的pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶活性的降低，在同时沉默p53 后能够得到部分恢复。利用p53+/+ 和p53-/- 的HCT116 细胞，进一步检测GSK-3β 对pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶活性的影响，发现只有在正常表达p53 的细胞中才能观察到GSK-3β 沉默引起的萤光素酶表达的下调。这些结果均支持GSK-3β 是通过降低p53 的水平来下调let-7 的表达的。
■ 详细实验方法与数据结果详见文献。