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太skr! pmirGLO载体,让miRNA靶基因不再神秘

日期: 2018-08-06
浏览次数: 2209

miRNA 研究背景

miRNA 研究背景

microRNA(miRNA) 广泛存在于真核细胞中,是内源性的具有调控功能的非编码RNA, 大小长约17~24 个核苷酸,能够形成RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),主要通过碱基互补配对的方式结合靶mRNA的3’ 非翻译区(UTR) 的种子序列(miRNA 中介导靶序列结合的2-7 个核苷酸组成的小片段区域称为“seed sequence”种子序列),根据互补程度的不同降解靶mRNA 或者阻遏靶mRNA的翻译,使靶基因沉默。



太skr! pmirGLO载体,让miRNA靶基因不再神秘

miRNA 研究方向

miRNA 参与各种各样的调节途径,包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡等等。但到目前为止,只有一小部分miRNA 生物学功能得到阐明。miRNA也被用来作为一些疾病的标志物,甚至药物候选,miRNA的作用也在被世界各地的研究者不断揭示。


今天,小麦就要给还在研究miRNA的科学家们推荐一款省时省力的miRNA研究工具——

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector, 方便易用的miRNA 靶基因验证载体。

miRNA靶基因验证研究思路举例

太skr! pmirGLO载体,让miRNA靶基因不再神秘

pmirGLO 技术原理及产品信息

pmirGLO 报告基因检测技术:是由pmirGLO 载体,检测试剂及配套相关产品组成的完整解决方案。

特点

• 专为miRNA 研究设计

• 细胞水平的验证方法:更能说明miRNA 与其靶序列或靶基因的作用。

• 新型萤光素酶报告基因检测法:一个载体带有两个报告基因。无需再共转染两个载体。萤火虫萤光素酶作主报告基因,海肾萤光素酶作内参报告基因。

• 强度适中的组成型启动子:萤火虫萤光素酶基因上游带有PGK 启动子,表达水平中等,反应更灵敏,可用于内源性miRNA 活性的检测

• 携带新霉素抗性:可用于建立稳转细胞株。

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•操作流程:

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应用文献举例分析

筛选有效的miRNA 或siRNA

Novel MicroRNA Reporter Uncovers Repression of Let-7 by GSK-3β

Rong Guo, Kotb Abdelmohsen, Patrice J. Morin, Myriam Gorospe

PLOS ONE, June 2013; 8: 1-11

■应用载体:pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

■ 应用检测试剂:Dual-Luciferase® Reporter Assay system

■ 研究目的:let-7 microRNA 家族被认为是一类肿瘤抑制因子,可通过结合到Ras 和HMGA2 等蛋白mRNA 的3’-UTR 来下调这些肿瘤形成相关蛋白的表达。在卵巢癌中存在let-7 的下调,而在小鼠肺癌和乳腺癌模型中过表达let-7 可以抑制肿瘤生长。

为了系统性研究细胞中调控let-7 生成的的机制,需要建立一种快速筛选系统来对细胞内的let-7 进行定量。作者建立了一套基于pmirGLO 载体的快速、高度灵敏的let-7 报告基因检测系统。利用该系统可以快速鉴定出影响let-7 活性水平的信号通路,揭示let-7 的调控机制。

■ 研究思路

•  利用pmirGLO 报告基因载体建立快速筛选let-7 活性的检测系统

根据文献,细胞内多种mRNA 的3’-UTR 上含有let-7 的结合序列,利用pmirGLO 载体构建了6 个带有不同let-7 靶位点(let-7 target site,LCS)的质粒。将这些载体分别转染到两种卵巢癌细胞系UCI-101 和BG-1 中,通过检测过表达的let-7 对萤火虫萤光素酶报告基因表达的下调水平,来筛选出一个抑制程度最强的let-7 靶位点质粒(pmirGLO-let7)用于后续研究。

人源细胞中存在9 种成熟的let-7 miRNA,将这9 种let-7 分别在BG-1 细胞中过表达后再转染pmirGLO-let7 质粒,发现9 种let-7 对萤火虫萤光素酶的表达均有抑制,说明该质粒能够有效应用于监测细胞中整体的let-7 水平。

•  利用转染pmirGLO-let7 质粒的UCI-101 和BG-1 细胞筛选激酶抑制剂以寻找卵巢癌细胞中调控let-7 水平的信号通路

利用pmirGLO-let7 质粒检测了Screen-WellTM 激酶抑制剂库中的80 种化合物对let-7 活性的影响, 发现加入化合物

Kenpaullone 能够明显降低萤火虫萤光素酶的活性,说明该化合物能提高细胞内let-7 的水平。该化合物是GSK-3β 的抑制剂。

•  利用GSK-3β siRNA 进一步验证GSK-3β 与细胞内let-7 水平的相关性

GSK-3β siRNA 下调细胞内GSK-3β 的表达后,pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶的活性降低,与上述抑制剂实验结果吻合,同时BG-1 细胞的存活率下降。下调GSK-3β 的表达后通过RT-qPCR 直接检测到细胞中let-7 miRNA 表达升高。说明GSK-3β可特异性下调let-7 的表达。

•  研究GSK-3β 下调let-7 表达的机制

文献报道结肠癌细胞中沉默GSK-3β 触发的细胞死亡与p53 表达上调有关。作者在BG-1 细胞发现了同样的结果。沉默GSK-3β 引起的pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶活性的降低,在同时沉默p53 后能够得到部分恢复。利用p53+/+ 和p53-/- 的HCT116 细胞,进一步检测GSK-3β 对pmirGLO-let7 载体上萤火虫萤光素酶活性的影响,发现只有在正常表达p53 的细胞中才能观察到GSK-3β 沉默引起的萤光素酶表达的下调。这些结果均支持GSK-3β 是通过降低p53 的水平来下调let-7 的表达的。

■ 详细实验方法与数据结果详见文献。


研究细胞内源性miRNA 活性

Transforming growth factor-β1 selectively inhibits hepatocyte growth factor expression via a micro-RNA-199-dependent posttranscriptional mechanism

Ognoon Mungunsukh and Regina M. Day

Molecular Biology of the Cell, July 2013; 24:2088-2097

■ 应用载体:pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

■ 应用检测试剂:Dual-Luciferase® Reporter Assay system

■ 研究目的:肝细胞生长素(Hepatocyte growth factor, HGF) 是由间叶细胞分泌的一种多功能内源性的修复因子,可促进正常组织再生,抑制成纤维化形成等。NK2 是HGF 的一种选择性剪切的亚型,作用是拮抗HGF 的抗成纤维化功能。转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1) 会抑制HGF 的表达,而不抑制NK2 的表达。本文的目的是为了研究TGF-β1 选择性抑制HGF 的机制。

■ 研究思路:

•  根据文献报道TGF-β1 抑制细胞内HGF 表达,而不影响NK2,通过RT-PCR 检测HGF 和NK2 的mRNA。

•  根据数据库检索,miR-199 可以识别HGF 的3’-UTR。检测TGF-β1 处理HLFb 细胞后是否会改变miR-199 表达量。

•  分别把HGF 和NK2 的3’-UTR 克隆到pmirGLO 载体中,转染到HLFb 细胞中,用pre-miR-199 联合处理,检测萤光素酶表达,确认pre-miR-199 的识别位点。

•  对HGF 3’-UTR 突变,克隆到pmirGLO 载体中,pre-miR-199 处理,确认pre-miR-199 是否特异识别HGF-3’UTR。

•  应用anti-miR-199a 和TGF-β1 联合处理HLFb 细胞,检测HGF 表达量,确认TGF-β1 是否通过miR-199 选择性抑制HGF 表达。

■ 详细实验方法与数据结果详见文献。


鉴定miRNA 靶位点

The miR200 Family of MicroRNAs Regulates WAVE3-dependent Cancer Cell Invasion

Khalid Sossey-Alaoui, Katarzyna Bialkowska, and Edward F. Plow

J. Biol. Chem., Nov 2009; 284: 33019-33029

■ 应用载体:pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

■ 应用检测试剂:Dual-Luciferase® Reporter Assay system

■ 研究目的:已有的研究结果证明miRNA 可以参与抑制或促进肿瘤的生长,如miR-200 家族参与癌症的侵袭和转移过程中由上皮组织向间充质过渡的过程;作者之前的研究发现WAVE3 蛋白参与细胞的运动和迁移,WAVE3 蛋白与乳腺癌的进展加重密切相关。WAVE3 蛋白表达与miR-200 水平之间可能存在联系。

■ 研究思路:

•  数据库或软件搜索,研究WAVE3 mRNA 上是否有miR-200 家族的结合位点。

•  在细胞中检测,WAVE3 RNA 水平和miR-200 表达水平间是否存在负相关。

•  使用pmirGLO 报告基因载体验证WAVE3 mRNA 上的miR-200 结合位点。

•  功能研究:验证miR-200 对细胞侵袭特性的影响。

■ 详细实验方法与数据结果详见文献。


应用文献列表

1. miR-124a is required for hippocampal axogenesis and retinal cone survival through Lhx2 suppression.

Rikako Sanuki, Akishi Onishi, Chieko Koike, Rieko Muramatsu, Satoshi Watanabe, Yuki Muranishi, Shoichi Irie, Shinji Uneo, Toshiyuki Koyasu, Ryosuke Matsui, Yoan Chérasse,Yoshihiro Urade, Dai Watanabe, Mineo Kondo, Toshihide Yamashita&Takahisa Furukawa

Nature Neuroscience 2011,14, 1125–1134

应用产品:

• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

2. NEW PLAYERS, OLD TRICKS:Abstract 121: Novel epigenetic mechanisms of resveratrol regulation of PTEN/Akt pathway in prostate cancer.

Swati Dhar, Kun Li, Steven J. Dias, and Anait S. Levenson

Cancer Res., Apr 2012; 72: 121.

应用产品:

• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

• Dual-Luciferase® Reporter Assay system

3. miR-1247 Functions by Targeting Cartilage Transcription Factor SOX9.

Aida Martinez-Sanchez and Chris L. Murphy

J. Biol. Chem., Oct 2013; 288: 30802 - 30814.

应用产品:

• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

•  Dual-Glo® Reporter Assay system

4. Biogenesis of mammalian microRNAs by a non-canonical processing pathway

Mallory A. Havens, Ashley A. Reich, Dominik M. Duelli, and Michelle L. Hastings

Nucleic Acids Res., May 2012; 40: 4626 - 4640.

应用产品:

• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

• Dual-Glo® Reporter Assay system

• GoScriptTM Reverse Transcriptase

5. MicroRNAs are critical regulators of tuberous sclerosis complex and mTORC1 activity in the size control of the Xenopus kidney

Daniel Romaker, Vikash Kumar, Débora M. Cerqueira, Ryan M. Cox, and Oliver Wessely 

PNAS, Apr 2014; 111: 6335 - 6340.

应用产品:

• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

• Dual-Luciferase® Reporter Assay system

6. EBV and human microRNAs co-target oncogenic and apoptotic viral and human genes during latency

Kasandra J Riley, Gabrielle S Rabinowitz, Therese A Yario, Joseph M Luna, Robert B Darnell, and Joan A Steitz

EMBO J., May 2012; 31: 2207 - 2221.

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• pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

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用途

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector

E1330

优化的miRNA靶基因验证专用载体

Dual-Luciferase® Reporter Assay System

E1910
E1960
E1980

闪光型双报告基因检测

Dual-Glo® Luciferase Assay System

E2920
E2940
E2960

辉光型双报告基因检测



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