服务热线: 010-82349466
新闻中心 News
联系我们

Broad研究所开发出功能更强大的CRISPR文库

日期: 2018-11-12
浏览次数: 205

最近,Broad研究所的David Root和John Doench实验室开发出人类全基因组范围的CRISPRko(敲除)、CRISPRi(干扰)和CRISRPa(激活)文库。与其他的CRISPR文库相比,它们在sgRNA数量更少的情况下表现更为出色。

Broad研究所开发出功能更强大的CRISPR文库

CRISPR混合文库的出现让研究人员能够轻松地开展全基因组筛选,从而更高效地研究基因功能。通过将特异性sgRNA与Cas9或Cas9衍生物相结合,CRISPR文库可用于敲除、抑制或激活靶基因。


最近,Broad研究所的David Root和John Doench实验室开发出人类全基因组范围的CRISPRko(敲除)、CRISPRi(干扰)和CRISRPa(激活)文库。这些文库利用优化的sgRNA,它们是根据Doench等人2014年提出的规则来设计的。与其他的CRISPR文库相比,它们在sgRNA数量更少的情况下表现更为出色。


Brunello:人类CRISPRko sgRNA文库

Brunello文库包括77,441条sgRNA,平均每个基因对应4条sgRNA,以及1,000条非编码对照sgRNA。此文库的设计是为了提高人类基因组中的on-target活性,同时降低off-target效应。


在测试文库时,研究人员用A375(黑色素瘤)和AT29(结肠癌)细胞进行全基因组阴性选择筛选,并通过金标准基因集合的去除来评估文库性能。根据各项指标,他们发现Brunello文库在必需基因的去除上比其他的CRISPR文库更有效。在某些基因的分析中,仅有一条sgRNA的Brunello文库的表现甚至优于另一个有六条sgRNA的CRISPR文库,这突出了sgRNA设计的优势。


Dolcetto:人类CRISPRi sgRNA文库

尽管CRISPRko文库在鉴定hit方面非常有效,但它们确实存在一些限制。CRISPRko导致功能完全丧失,这意味着如果必需基因在需要筛选的表型中发挥作用,则可能会错过它,因为它对于生存至关重要。因此,CRISPRi文库提供了一种很好的替代方法,在筛选功能丧失表型的同时又绕过这些问题。


CRISPRi文库利用经过改造的Cas9,它的核酸酶结构域中含有多个点突变。这些突变导致RNA指导的DNA结合蛋白无活性(dCas9)。然后将dCas9与抑制结构域连接,比如KRAB,以阻止sgRNA靶点的有效转录。CRISPRi在转录起始位点(TSS)周围的小范围内有效。


Root和Doench实验室在此最佳窗口内选择sgRNA,并根据优化的挑选规则和潜在的脱靶效应对它们进行排序。Dolcetto文库包含两组sgRNA:A组是排名前三的sgRNA,B组是排名四至六的sgRNA。他们发现,仅含有3条sgRNA的Dolcetto文库(A组)也优于含有10条sgRNA的CRISPRi文库,再次证明了sgRNA设计的重要性。


Calabrese:人类CRISPRa sgRNA文库

除了抑制基因表达,dCas9也能用于转录激活。特定基因的激活让研究人员能够开展全基因组的功能获得筛选。目前已开发出多种策略将转录元件招募到dCas9及sgRNA指导的结合位点,包括将dCas9与激活结构域(如VP16)融合,或招募多个拷贝的VP16。此外也可对sgRNA或tracrRNA序列进行修饰。


Root和Doench实验室利用带有两个PP7茎环的tracrRNA来招募额外的转录因子。将此tracrRNA与sgRNA表达载体相结合开展筛选。与CRISPRi一样,CRISPRa仅在sgRNA靶向特定位置时有效,具体来说是TSS上游的150-75个核苷酸。同样,他们根据挑选规则和脱靶效应对sgRNA进行排序。每个基因选择6个最好的sgRNA,并且分为A和B两组。他们发现,Calabrese文库能够鉴定出更多的hit。


此外,研究人员在研究MEK抑制剂的耐药性时,比较了Calabrese文库和开放阅读框(ORF)过表达文库。尽管两种文库鉴定出一些重叠的基因,但大多数基因是独特的。这些hit在另一种筛选中可能呈现假阴性,这意味着CRISPRa文库和ORF文库在研究基因功能时是互补的。


总的来说,Root和Doench实验室已经证明,他们的CRISPRko、CRISPRi和 CRISPRa文库在探索基因功能上是非常有效的,并且需要的sgRNA更少。这些文库让研究人员能够在更加严苛的条件下开展全基因组范围的筛选,比如数量有限的原代细胞。


转自生物谷


Hot News / 相关推荐
  • 2020 - 08 - 20
    点击次数: 51
    开学季活动攻略来了        嗨!亲爱的伙伴,我们在2020年的秋季终于见面了!无论你在哪里,我们都会一直默默的陪伴。伴随着金色的九月,开学的季节,我们展开了多种活动,来和你一起开学。活动多多,奖品多多,还在等什么,快来参与啊!活动一:你留言,我送礼! 在本次活动中,亲爱的伙伴,如果你在公众号后台留言,留言入选,便可获得精美礼品。留言...
  • 2020 - 02 - 12
    点击次数: 44
    开工大吉,共克时艰今天正月十七,开工第一天在此向所有奋战一线的工作者致敬,感谢客户们一如既往的信任和大力支持!优健萌威将继续为您提供更好的服务。2020,我们一起奔跑,一起追梦,和我们共同开启热血的一年!小编为大家整理了现在公司现有库存的手套,少量现货,先抢先得!拼手速!抢!抢!抢!
  • 2019 - 12 - 25
    点击次数: 54
    电子显微镜下的假单胞菌细菌。图片来源:MPIIB / Volker Brinkmann近日,发表在《Science》上的一项研究中,来自德国马克斯·普朗克感染生物学研究所(MPIIB)的科学家们发现,人体具有一个特殊受体,它虽然不能识别细菌本身,但可以很好地监视细菌间的通信,持续监测感染动态,当有大量细菌存在以至于分泌出被称为毒力因子的致病物质时,该受体会向宿主发出调整免疫反应的信号。细...
  • 2019 - 11 - 05
    点击次数: 65
    双十一活动攻略来了!我们的活动时间是:2019.11.1-11.5活动持续两周。小伙伴们赶紧奔走相告吧!我们一起狂欢嗨购!VWR大咖亮相,询价有礼活动期间询价具体货号商品,即可赠送精美签字笔一支;下单任意VWR商品,送VWR订制款旅行套装;报货号抽大奖表单中添加5个以上实验室使用过的产品货号,即可参与抽奖;参与方式:识别下方二维码进入表单,添加产品货号后提交,点击抽奖即可;抽奖礼品由销售送达双11...
  • Copyright © 2005 - 2013 北京照生莱博商贸有限公司
    犀牛云提供企业云服务