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HiBiT标签的检测那么有了融合标签之后,我们要如何进行定量检测呢?HiBiT系统提供了三种灵活的方案,第一种就是快速方便的裂解检测方案。裂解检测系统就是将细胞完全裂解后,试剂中的LgBiT亚基和融合蛋白上的HiBiT标签迅速结合,启动萤光素酶反应,发光的亮度就和细胞内的HiBiT标签多少成正比。由于萤光素酶反应非常迅速,因此只需要五分钟就可以对样品内的融合蛋白进行迅速准确的定量。第二种检测系统和Western Blot很像。电泳和转印之后,可以直接使用HiBiT印迹检测系统进行目标蛋白的亲和杂交,然后通过萤光素酶反应进行条带的发光检测。由于不需要封闭和抗体,相比Western Blot既省时又省力。第三种检测方案是HiBiT胞外检测系统。这个系统专门为研究外泌蛋白或者细胞膜表面蛋白而设计。我们加入的试剂不含有裂解组分,其中的LgBiT只能和细胞膜表面或者分泌到培养基中的HiBiT蛋白结合,这种操作不裂解细胞,因此样品还可以进行其他的细胞分析和分子实验。与CRISPR双剑合璧在过去的蛋白重组表达中,研究人员通常会使用外源的蛋白表达载体在细胞内进行蛋白表达调控和功能的研究,这种手段简单直接,曾经为我们带来了很多宝贵的成果,但是这种外源表达有相当的局限性。下图是研究缺氧诱导条件下HiF1A蛋白的积累,我们可以看到,随着携带外源表达蛋白的瞬转质粒浓度的增加,同样的药物处理带来的蛋白表达响...
发布时间: 2018 - 07 - 20
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HiBiT——精致小标签的诞生故事首先还是要从NanoLuc说起,科学家发现,虽然NanoLuc很小,但是距离理想的蛋白融合标签,还是有一定的差距。于是Promega的科学家绞尽脑汁想创造一个更小的蛋白融合标签,他们发现在第156和第157氨基酸的位置咔嚓一刀,可以将NanoLuc切成一大一小两个亚基(分别是11aa的小亚基,和156aa的大亚基LgBiT),这两个亚基分开时都不具有发光活性,但是组合起来之后,又能够恢复萤光素酶的活性!这就好像把插销插入电路一样,这个只有11aa的小亚基一旦和大亚基结合,就能够恢复萤光素酶的发光活力!科学家对针大小亚基分别进行了一系列的突变改造,获得了多种亲和力强度的组合。在这些组合中,科学家将亲和力最弱的改型组合命名为NanoBiT系统,专门用来研究蛋白之间的相互作用(这部分的内容可参看Annexin-V实时凋亡系统的介绍文章)。而亲和力最强的一对组合就是今天的主角:HiBiT系统!一个标签的自我修养怎样成为一个优秀的标签?对于一个标签来说,首先它应该是很小,完美的融入到目标蛋白中,就像一个演员,他的表演他的塑造是为所扮演的角色和剧情所服务,而不能让自己的形象过于突兀。HiBiT就是这样一个很袖珍的标签,它只有11个氨基酸的长度,几乎不会影响目标蛋白的正常功能。那么标签太大会有什么后果呢?如果标签过大,很可能会影响与之融合蛋白的正常构象,以及对正...
发布时间: 2018 - 07 - 13
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NanoLuc® 是谁?大龙虾,可生吃,可做汤;小龙虾,可麻辣,可蒜香。今天的故事我们首先要从餐桌上的虾讲起,说起来,虾这个家族为我们的餐桌文化可是做出了重大贡献。 然而最近科学家一种深海的小虾(学名Oplophorus gracilirostris)身上获得了一种个头很小的萤光素酶,经过工程处理之后,把它取名为NanoLuc。要说到萤光素酶,就得谈谈两位萤光素酶界的老前辈——萤火虫(firefly)和海肾(renilla)萤光素酶,如果您恰好做过做过双萤光素酶报告基因检测,那么这两个名字肯定是记得非常清楚了。和这两位前辈相比,新晋出道的NanoLuc有啥特点呢?第一个特点就是——“小”!和这位19kDa的小鲜肉比起来,61kDa的萤火虫萤光素酶和36kDa的海肾萤光素酶简直就是巨人一样的存在。对于一个以发光为己任的萤光素酶来说,个头小有什么好处呢?【1】     第一个作用就是可以用来做融合蛋白标签啦!由于萤火虫和海肾萤光素酶的个头太大,导致它们一直没法打入融合蛋白的市场。而NanoLuc的个头只有19kDa。比我们所熟悉的GFP融合蛋白(大约27kDa)还要小不少,所以萤光素酶家族终于可以头顶青天泪流满面的说:我终于可以做融合蛋白啦!【2】     这个来自深海小龙虾的...
发布时间: 2018 - 07 - 05
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Promega与大象研究                                                                                                                                         Virginia Pearson女士                        ...
发布时间: 2018 - 06 - 22
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